abts是什么试剂_ABTS是什么试剂_1

       感谢大家在这个abts是什么试剂问题集合中的积极参与。我将用专业的态度回答每个问题，并尽量给出具体的例子和实践经验，以帮助大家理解和应用相关概念。

1.有谁对ELISA试剂盒了解

2.ELISA试剂盒有几种检测方法

3.elisa试剂盒的主要设备

4.总抗氧化能力试剂盒和清除abts的区别

5.elisa试剂盒的测试要求

6.细胞凋亡的免疫学检测方法有哪几种（注意是免疫学的方法）

有谁对ELISA试剂盒了解

       （一）ELISA测定技术的发展

        然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。 一、Elisa试剂盒测定技术的发展 临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。 1、基因工程试剂对免疫测定技术 发展的影响 免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。 HBsAg试剂特点（检测模式：临 床抗体夹心法）： 包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。 酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。 可测得HBsAg变异样品。 提高检测的特异性（99.98%） 提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml elisa试剂盒的用途 测试剂盒检测原理 ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒 的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性

       [编辑本段]（二） 操作步骤

        方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二 用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。 ↓ 加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔 中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照） ↓ 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml， 37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 ↓ 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

       [编辑本段]（三） 试剂器材

        1. 试剂 （1） 包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）: NaHCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml （2） 洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克 KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml （3） 稀释液： 牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 （4） 终止液（2M H2SO4）： 蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。 （5） 底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）: 0.2MNa2HPO4（28.4克／L）25.7ml 0.1M柠檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸馏水50ml。 （6） TMB（四甲基联苯胺）使用液: TMB（10mg／5ml无水乙醇）0.5ml 底物缓冲液（PH5.5） 10ml 0.75％H2O2 32μl （7） ABTS使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl （8） 抗原、抗体和酶标记抗体。 （9） 正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材: （1） 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 （2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 （3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。

ELISA试剂盒有几种检测方法

       酶联免疫诊断试剂盒（上海科华的试剂盒）的底物A就是显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2）,底物B就是显色剂B（含TMB）,用于显色。 另外，常用的底物还有：1）AP的底物，常用的为对-硝基苯磷酸脂（PNP），其反应物为**的对硝基酚，测读波长为405nm2）GOD的底物，为葡萄糖，供氢体为对硝基蓝四氮唑，反应产物为不溶性的蓝色沉淀 什么是TMB？TMB即四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，

       且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。

       TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。

       由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。

       TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试

       剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等

       优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈

       **，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。

       ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。

elisa试剂盒的主要设备

       1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃?过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

       2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃?孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

       3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃?孵育0.5～1小时，洗涤。

       4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃?10～30分钟。

       5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

       6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

       间接法

       1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；

       2.次日洗涤3次；

       3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；

       4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；

       5.37℃孵育35-60分钟，洗涤；

       6.’最后一遍用DDW洗涤。

       其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

总抗氧化能力试剂盒和清除abts的区别

       （1）　包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:

       Na2CO3 1.59克

       NaHCO3　 2.93克

       加蒸馏水至1000ml

       （2）　洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M

       KH2PO40.2克

       Na2HPO4·12H2O　2.9克

       NaCl　8.0克

       KCl　0.2克

       Tween-20　0.05%　0.5ml

       加蒸馏水至1000ml

       （3）　稀释液：

       牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

       加洗涤缓冲液至100ml

       或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。

       （4）　终止液（3M　H2SO4）：

       蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

       （5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）:

       0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml

       0.1M柠檬酸（19.2克/L）　 24.3ml

       加蒸馏水50ml。

       （6）　TMB（四甲基联苯胺）使用液:

       TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml

       底物缓冲液（PH5.5）　 10ml

       0.75%H2O2　32μl

       （7）　ABTS使用液:

       ABTS　0.5mg

       底物缓冲液（PH5.5）　 1ml

       3%H2O2　2μl

       （8）　抗原、抗体和酶标记抗体。

       （9）　正常人血清和阳性对照血清。

       器材

       （1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

       （2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

       （3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

       试验原理

       试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。

       自备材料

       1． 蒸馏水。

       2． 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

       3． 振荡器及磁力搅拌器等。

       安全性

       1． 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

       2． 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

       3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

       4． 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

       5． 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

       6． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

       7． 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

       8． 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

       9． 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

       10． 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

       11． 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

       12． 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

elisa试剂盒的测试要求

       设计实验都还要做空白对照、阳性对照和实验组。你把“一是用苹果作为对照，一种涂上该物质，一种没有”还要加一种本来就具有抗氧化的物质“涂在苹果上”才能显示出你要测定的物质是否具有抗氧化活性撒！测定抗氧化的方法很多的！除了看其对自由基的清除作用，测定油脂的过氧化也是很不错的方法！...

细胞凋亡的免疫学检测方法有哪几种（注意是免疫学的方法）

       ELISA的实验操作所要求的条件是比较严格的，无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求，都是如此。下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要注意的一些问题。

       一、ELISA实验通用规则

       1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但最好有专业人员进行矫正。

       2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。

       3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

       4、实验时，要使底物避光保存。

       5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

       6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

       7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。

       8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。

       9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。

       10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。

       11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。

       12、底物是光敏感的，要在临用前现配。

       13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。

       14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。

       15、待检样品要澄清，否则会影响结果。

       16、温浴时间应遵守试剂盒规定。

       17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。

       18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。

       二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法

       1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

       a.原因：未加入酶标记物。

       解决办法：请按照操作步骤进行。

       b.原因：试剂盒内容物未能充分回。

       解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

       c.原因：室温太低。

       解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。

       d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。

       解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。

       e.原因：试剂盒已过有效期限。

       解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。

       2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。

       a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。

       解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。

       b.原因：操作时间拖太久。

       解决办法：请在方法熟练后再进行操作。

       c.原因：微孔间相互污染。

       解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

       d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。

       解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。

       e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。

       解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

       f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。

       解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

       3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。

       a.原因：室温太高(>25℃)。

       解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。

       b.原因：底物溶液受到污染。

       解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。

       c.原因：反应时间超过太久。

       解决办法：请控制反应时间。

       d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。

       解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)

       4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。

       a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。

       解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。

       b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。

       解决办法：请参考2-f.

       c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。

       解决办法： 请参考2-d.

测定 abts 时制备细胞样本时可以用裂解液吗

       一、概述

       细胞凋亡（apoptosis,Apo）是细胞增殖的反面，探讨的是细胞死亡的方式与机制。凋亡一词来源于希腊语。原指花瓣、叶片的脱落。自1972年Kerr首次提出细胞凋亡的概念以来，随着细胞生物学、免疫学和肿瘤学的研究发展，最近几年人们对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更深的理解。细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。不同类型的细胞，在发生凋亡时的动力学过程也不一致，存在着一定的形态学和生物化学的差异，但若干基本变化是大同小异的。其特征为：整个胞体呈浓缩状，有特异性胞浆大泡，胞质、核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体（apoptosis body）。它有别于细胞死亡（necrosis,Nec）。在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的DNA梯状图谱。它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核酸内切酶激活后，裂解染色质核小体（nucleosome）之间的连接DNA，将核小体切割成180bp～200bp或其倍数的片段所致。Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器，凋亡小体在组织中很快被邻近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。Apo是机体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因指导的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。

       光镜下，Apo的典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显的迂曲。体内细胞凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并降解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不适宜应用形态学方法（普通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法、凋亡小体的电镜观察及凋亡指数和细胞活力的定量测定）来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其灵敏度高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。它是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近几年，人们又发现了能更快、更敏感、检测细胞数量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流式细胞分析术（flow cytometry，FCM 包括亚“G1”峰检测法和末端转移酶标记技术）等。本章仅介绍免疫学检测方法。

       二、ELISA法

       （一） 原理

       细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。

       （二）材料与试剂

       1．采用Boehringer Mannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗

       体。

       2．过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体

       3．链霉亲合素包被的微孔板

       4．DNA－组蛋白复合物，作为阴性对照。

       5．ABTS底物

       6．溶解缓冲液

       7．温育缓冲液

       8．底物缓冲液

       （三）样品

       1．培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200?l溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。

       2．培养细胞的上清液

       3．血浆（血清）

       （四）操作方法

       1．取样品离心后（1 000r/min,10min）,吸取20?l上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。

       2．另加入80?l免疫反应试剂 含抗－DNA－POD、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1∶1∶18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。

       3．取上清，用300?l温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。

       4．加入100?l底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。

       5．尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

       （五）结果判定

       按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：

       注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸

       收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。

       三、原位末端转移酶标记技术

       （一）原理

       凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。

       （二）荧光标记法

       1．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor公司ApopTagTM试剂盒，包括：

       ⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)1nmol/?l

       ⑵ TdT酶（25U/μl）

       ⑶ 反应缓冲液

       ⑷ 洗涤缓冲液

       ⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5?g/ml）或抗地高辛抗体（1∶30）

       ⑹ PI染液（含PI 5?g/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）

       ⑺ PBS缓冲液

       ⑻ 塑料盖玻片

       2.样品

       ⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

       ⑵ 贴壁生长的培养细胞

       ⑶ 冰冻切片

       ⑷ 常规石蜡切片

       3.操作方法

       （1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

       （2）洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min,三次。

       （3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶0.5μl,标记的-dUTP 1μl）,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h。

       （4）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

       （5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min。

       （6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

       （7）PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。

       （8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

       4.结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细

       胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。

       (三)酶标记法

       1.材料与试剂 采用美国Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒，包括：

       ⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

       ⑵ 反应缓冲液

       ⑶ TdT酶

       ⑷ 反应终止/洗涤液

       ⑸ 平衡缓冲液

       ⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。

       ⑺ 30% H2O2

       ⑻ DAB显色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前过滤并加入

       0.02% H2O2。

       ⑼ 甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0。

       ⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片

       2．样品 同荧光标记法。

       3．操作方法

       ⑴ 固定：同荧光标记法。

       ⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H2O2缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min后，同荧光标记法洗涤。

       ⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，洗涤

       同上。

       ⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70?l／cm2）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min～10min。

       ⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50?l/㎝2，18μl TdT酶+36μl反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37℃温育1h。

       ⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min（置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

       ⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30min。

       ⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

       ⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min～6min。

       ⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤3次，每次3min～6min。

       ⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min。

       ⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤3次（置于摇床上），每次2min。

       ⒀ 脱水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。

       明胶甘油封片。

       4．结果判定 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染

       色质显示出特异性的棕**。

       测定 abts 时制备细胞样本时可以用裂解液

       裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解.化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA 断裂.这两种方法（包括SDS 和溶菌酶处理等）提取纯化DNA中常用的方法.机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性.机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA 的断裂.

       一、机械裂解法主要有以下两中：

       1．热休克（Thermal shock）,既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,.原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.

       2．超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.

       二、 化学裂解和酶裂解法（在提核酸时联合使用）

       主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性.

       主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：

       50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系）,150 mM NaCl（等渗体系）,1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂）,1 mM EDTA（变性剂和稳定剂）,5 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂）,5 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂）,1% Triton x-100（破坏细胞）,1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂）,0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）.7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解）,蛋白酶K等.

       好了，关于“abts是什么试剂”的讨论到此结束。希望大家能够更深入地了解“abts是什么试剂”，并从我的解答中获得一些启示。